Northern blot es una técnica basada en el principio de blot para el análisis de ARN específico en una mezcla compleja.
La técnica es una versión modificada del Southern Blotting, que se descubrió para el análisis de secuencias de ADN.
La detección de determinadas secuencias de ácidos nucleicos extraídos de diferentes tipos de muestras biológicas es fundamental en biología molecular, lo que hace imperativas las técnicas de blotting en el campo.
El principio es idéntico al de la transferencia Southern excepto por las sondas utilizadas para la detección, ya que la transferencia Northern detecta secuencias de ARN.
Esta técnica proporciona información sobre la longitud de las secuencias de ARN y la presencia de variaciones en la secuencia.
Aunque la técnica se centra principalmente en la identificación de secuencias de ARN, también se ha utilizado para la cuantificación de secuencias de ARN.
Desde el descubrimiento de la técnica, se han realizado varias modificaciones en la técnica para el análisis de ARNm, pre-ARNm y ARN cortos.
La transferencia Northern se empleó como técnica principal para el análisis de fragmentos de ARN durante mucho tiempo; sin embargo, técnicas nuevas, más convenientes y rentables como la RT-PCR han reemplazado lentamente a la técnica.
Principio de Northern Blot
El principio de la transferencia Northern es el mismo que el de todas las demás técnicas de transferencia que se basan en la transferencia de biomoléculas de una membrana a otra.
Las muestras de ARN se separan en geles según su tamaño mediante electroforesis en gel. Dado que los ARN son monocatenarios, estos pueden formar estructuras secundarias por apareamiento de bases intermoleculares. La separación electroforética de los segmentos de ARN se realiza así en condiciones desnaturalizantes.
Los fragmentos de ARN separados se transfieren luego a una membrana de nailon. La membrana de nitrocelulosa no se usa porque el ARN no se une de manera efectiva a la membrana.
Los segmentos transferidos se inmovilizan sobre la membrana mediante agentes de fijación. Los fragmentos de ARN en la membrana se detectan mediante la adición de una sonda marcada complementaria a las secuencias de ARN presentes en la membrana.
La hibridación forma la base de la detección de ARN ya que la especificidad de la hibridación entre la sonda, y el ARN permite la identificación precisa de los segmentos.
La transferencia Northern utiliza la separación dependiente del tamaño de los segmentos de ARN y, por tanto, puede usarse para determinar los tamaños de las transcripciones.
La solución de gel de ARN se prepara agregando formaldehído a la solución de agarosa.
El yeso se ensambla y el gel desnaturalizante preparado se vierte en el yeso. A medida que el gel comienza a fraguar, se agrega un peine con los dientes adecuados para formar pozos.
Una vez que se endurece el gel, se retira el peine y el gel se equilibra con un tampón de funcionamiento durante 30 minutos antes de ejecutarlo.
Se mezclan 15 µg de muestra de ARN con un volumen igual de tampón de carga de ARN. Se añaden tres µg de marcadores de ARN en el mismo volumen de tampón de carga de ARN.
Las muestras se incuban a 65 ° C en un bloque calefactor durante aproximadamente 12-15 minutos.
Las muestras se cargan en el gel equilibrado y la primera fila de pocillos se llena con marcadores de ARN.
A continuación, se hace funcionar el gel a 125 V durante aproximadamente 3 horas.
B. Transferencia de ARN del gel a la membrana de nailon
Se corta una membrana de nailon que es más grande que el tamaño del gel desnaturalizante y también se prepara un papel de filtro del mismo tamaño que la membrana de nailon.
Una vez que se completa el proceso de electroforesis, el gel de ARN se retira del tanque y se enjuaga con agua.
Se coloca una esponja oblonga que es un poco más grande que el gel en un plato de vidrio, y el plato se llena con SSC hasta un punto para dejar la esponja empapada medio sumergida en el tampón.
Se colocan algunos trozos de papel Whatman de 3 mm encima de la esponja y se humedecen con tampón SSC.
Luego, el gel se coloca sobre el papel de filtro y se exprime para eliminar las burbujas de aire haciendo rodar una pipeta de vidrio sobre la superficie.
La membrana de nailon preparada se humedece con agua destilada en una placa sin RNasa durante aproximadamente 5 minutos.
La membrana humedecida se coloca sobre la superficie del gel evitando la formación de burbujas de aire.
La superficie se inunda aún más con SSC y se colocan algunos papeles de filtro más encima de la membrana.
Se coloca una placa de vidrio en la parte superior de la estructura para mantener todo en su lugar. La estructura se deja durante la noche para obtener una transferencia efectiva.
C. Inmovilización
Una vez que se completa la transferencia, el gel se retira y se enjuaga con SSC y se deja secar.
La membrana se coloca entre dos trozos de papel de filtro y se cuece en un horno de vacío a 80 ° C durante 2 horas.
En algunos casos, la membrana se puede envolver en una envoltura de plástico transparente a los rayos ultravioleta y se irradia durante un tiempo apropiado en un transiluminador de rayos ultravioleta.
D. Hibridación
Las sondas de ADN o ARN para ser utilizados han de ser marcada a una actividad específica de> 10 8 dpm / g, y los nucleótidos no incorporados se van a eliminar.
La membrana que lleva el ARN inmovilizado se humedece con SSC.
La membrana se coloca en un tubo de hibridación con el ARN hacia arriba y se agrega 1 ml de solución de formaldehído.
El tubo se coloca en el horno de hibridación y se incuba a 42 ° C durante 3 horas.
Si la sonda utilizada es de doble hebra, se desnaturaliza calentándola en un baño de agua o en una incubadora durante 10 minutos a 100 ° C.
El volumen deseado de la sonda se pipetea en el tubo de hibridación y se incuba adicionalmente a 42 ° C.
La solución se vierte y la membrana se lava con una solución de lavado. A continuación, se observa la membrana mediante autorradiografía.
Interpretación de resultados de Northern Blot
Las bandas de ARN se observan bajo radiografía en forma de bandas. La distancia de las bandas a los marcadores se puede utilizar para determinar la longitud y la semicuantificación de los fragmentos de ARN.
Aplicaciones de Northern Blot
La técnica se puede utilizar para la identificación y separación de fragmentos de ARN recolectados de diferentes fuentes biológicas.
La transferencia Northern se utiliza como una prueba sensible para la detección de la transcripción de fragmentos de ADN que se utilizarán como sonda en la transferencia Southern.
También permite la detección y cuantificación de ARNm específicos de diferentes tejidos y diferentes organismos vivos.
La transferencia Northern se utiliza como herramienta para los estudios de expresión génica relacionados con la sobreexpresión de genes que causan cáncer y la expresión génica durante el rechazo de trasplantes.
La transferencia Northern se ha utilizado como una herramienta molecular para el diagnóstico de enfermedades como la enfermedad de Crohn.
El proceso se utiliza como método para la detección de microARN virales que desempeñan funciones importantes en la infección viral.
Limitaciones de Northern Blot
La transferencia Northern tiene una sensibilidad menor en comparación con otras técnicas modernas como RT-PCR y ensayos de protección de nucleasas.
El método requiere una gran cantidad de ARN de muestra, y estos deben ser de alta calidad.
La técnica requiere mucho tiempo y es compleja, especialmente en los casos en los que se van a agregar varias sondas.
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