Secuenciación del ADN
Definición de secuenciación de ADN
La secuenciación de ADN es el proceso de determinar la secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN . El ADN de cada organismo consta de una secuencia única de nucleótidos. La determinación de la secuencia puede ayudar a los científicos a comparar el ADN entre organismos, lo que puede ayudar a mostrar cómo se relacionan los organismos.
Descripción general de la secuenciación de ADN
Esto significa que al secuenciar un tramo de ADN, será posible saber el orden en el que las cuatro bases de nucleótidos ( adenina, guanina, citosina y timina ) se encuentran dentro de esa molécula de ácido nucleico .
La necesidad de la secuenciación del ADN se hizo evidente por primera vez con la teoría de Francis Crick de que la secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN influía directamente en las secuencias de aminoácidos de las proteínas. En ese momento, se creía que un genoma completamente secuenciado conduciría a un salto cuántico en la comprensión de la bioquímica de células y organismos.
La secuenciación de ADN moderna consiste en métodos de alto rendimiento que permiten descubrir secuencias de ADN completas en cuestión de horas. Esta tecnología ha permitido que muchas empresas comiencen a ofrecer pruebas de ADN en el hogar. Muchos de los «resultados» encontrados por estas pruebas son simplemente correlaciones encontradas entre una variante genética y una determinada condición. Sin embargo, la tecnología también ha permitido a los científicos probar el ADN de muchos organismos para comprender mejor las relaciones evolutivas.
Ejemplo de secuenciación de ADN
Aunque la secuenciación del ADN solía llevar años, ahora se puede realizar en horas. Además, la primera secuencia completa de ADN humano costó alrededor de 3 mil millones de dólares. Ahora, ciertas compañías secuenciarán todo su genoma por menos de $ 1,000. Las pruebas más avanzadas analizarán cada nucleótido dentro de su genoma. Sin embargo, muchas empresas ofrecen ahora pruebas de polimorfismo de un solo nucleótido .
Estas pruebas se enfocan en nucleótidos individuales dentro de genes que pueden significar ciertas variantes genéticas. Estos SNP, como se los conoce, se han correlacionado con ciertas afecciones y pueden ayudar a predecir cómo sus genes pueden influir en su vida. Algunos SNP están relacionados con diversas enfermedades, mientras que otros están relacionados con su metabolismo y cómo su cuerpo procesa los nutrientes. Se han encontrado miles de correlaciones diferentes y la secuenciación del ADN se puede utilizar para averiguar cómo afecta su genoma a su vida.
Métodos de secuenciación de ADN
Hay dos tipos principales de secuenciación de ADN. El método de terminación de cadena clásico más antiguo también se llama método Sanger. Los métodos más nuevos que pueden procesar rápidamente una gran cantidad de moléculas de ADN se denominan colectivamente técnicas de secuenciación de alto rendimiento (HTS) o métodos de secuenciación de próxima generación (NGS).
Secuenciación de Sanger
El método Sanger se basa en un cebador que se une a una molécula de ADN desnaturalizado e inicia la síntesis de un polinucleótido monocatenario en presencia de una enzima ADN polimerasa , utilizando el ADN desnaturalizado como plantilla. En la mayoría de las circunstancias, la enzima cataliza la adición de un nucleótido. Por tanto, se forma un enlace covalente entre el átomo de carbono 3 ′ de la molécula de azúcar desoxirribosa en un nucleótido y el átomo de carbono 5 ′ del siguiente. Esta imagen a continuación muestra cómo se forma este vínculo.
Sin embargo, una mezcla de reacción de secuenciación tendría una pequeña proporción de nucleótidos modificados que no pueden formar este enlace covalente debido a la ausencia de un grupo hidroxilo reactivo , dando lugar al término ‘didesoxirribonucleótidos’, es decir, no tienen un 2 o Átomo de oxígeno 3 ‘en comparación con el correspondiente ribonucleótido. Esto terminaría prematuramente la reacción de polimerización del ADN. Al final de múltiples rondas de tales polimerizaciones, se crearía una mezcla de moléculas de diferentes longitudes.
En los primeros intentos de utilizar el método Sanger, la molécula de ADN se amplificó primero con un cebador marcado y luego se dividió en cuatro tubos de ensayo, cada uno con un solo tipo de ddNTP. Es decir, cada mezcla de reacción tendría solo un tipo de nucleótido modificado que podría causar la terminación de la cadena. Una vez completadas las cuatro reacciones, la mezcla de moléculas de ADN creadas por la terminación de la cadena se sometería a electroforesis en un gel de poliacrilamida y se separaba según su longitud.
En la imagen de arriba, se sometió a electroforesis una reacción de secuenciación con ddATP a través de la primera columna. Cada línea representa una molécula de ADN de una longitud particular, el resultado de una reacción de polimerización que se terminó con la adición de un nucleótido ddATP. La segunda, tercera y cuarta columnas contenían ddTTP, ddGTP y ddCTP respectivamente.
Con el tiempo, este método se modificó para que cada ddNTP tuviera un marcador fluorescente diferente. El cebador ya no era la fuente del marcador radiactivo o del marcador fluorescente. También conocido como secuenciación de tinte-terminador, este método utilizó cuatro tintes con espectros de emisión no superpuestos, uno para cada ddNTP.
La imagen muestra la diferencia entre los cebadores marcados, los dNTP marcados y los NTP terminadores teñidos.
La imagen de arriba muestra una representación esquemática de la secuenciación del terminador de tinte. Hay una única mezcla de reacción que contiene todos los elementos necesarios para el alargamiento del ADN. La mezcla de reacción también contiene pequeñas concentraciones de cuatro ddNTP, cada uno con una etiqueta fluorescente diferente. La reacción completa se ejecuta en un gel capilar . Los resultados se obtienen mediante un análisis de los espectros de emisión de cada banda de ADN en el gel. Luego, un programa de software analiza los espectros y presenta la secuencia de la molécula de ADN.
Secuenciación de alto rendimiento
La secuenciación de Sanger sigue siendo útil para determinar las secuencias de tramos relativamente largos de ADN, especialmente a volúmenes bajos. Sin embargo, puede resultar caro y laborioso cuando es necesario secuenciar rápidamente una gran cantidad de moléculas. Irónicamente, aunque el método tradicional de terminación por colorante es útil cuando la molécula de ADN es más larga, los métodos de alto rendimiento se han vuelto más utilizados, especialmente cuando es necesario secuenciar genomas completos.
Hay tres cambios importantes en comparación con el método Sanger. El primero fue el desarrollo de un sistema libre de células para clonar fragmentos de ADN. Tradicionalmente, el tramo de ADN que necesitaba secuenciarse se clonaba primero en un plásmido procariótico y se amplificaba dentro de las bacterias antes de extraerlo y purificarlo. La secuenciación de alto rendimiento o las tecnologías de secuenciación de próxima generación ya no dependían de este procedimiento que requiere mucho tiempo y trabajo.
En segundo lugar, estos métodos crearon espacio para ejecutar millones de reacciones de secuenciación en paralelo. Este fue un gran paso adelante desde los métodos iniciales donde se necesitaban ocho mezclas de reacción diferentes para producir una única secuencia de nucleótidos confiable. Finalmente, no hay separación entre los pasos de alargamiento y detección. Las bases se identifican a medida que avanza la reacción de secuenciación. Si bien HTS disminuyó el costo y el tiempo, sus ‘lecturas’ fueron relativamente cortas. Es decir, para ensamblar un genoma completo, es necesaria una computación intensa.
La llegada de HTS ha expandido enormemente las aplicaciones de la genómica. La secuenciación del ADN se ha convertido ahora en una parte integral de la ciencia básica, la investigación traslacional, el diagnóstico médico y la ciencia forense.
Usos de la secuenciación de ADN
La tecnología tradicional de terminación de cadena y los métodos HTS se utilizan para diferentes aplicaciones en la actualidad. La secuenciación de Sanger se utiliza ahora principalmente para la secuenciación inicial de novo de una molécula de ADN para obtener los datos de la secuencia primaria de un organismo o gen . Las «lecturas» relativamente cortas que provienen de una reacción HTS (30-400 pares de bases en comparación con las casi mil «lecturas» de pares de bases de los métodos de secuenciación de Sanger) dificultan la creación del genoma completo de un organismo a partir de métodos HTS únicamente. Ocasionalmente, también se necesita la secuenciación de Sanger para validar los resultados de HTS.
Por otro lado, HTS permite el uso de la secuenciación de ADN para comprender los polimorfismos de un solo nucleótido, entre los tipos más comunes de variación genética dentro de una población . Esto se vuelve importante en la biología evolutiva, así como en la detección de genes mutados que pueden provocar enfermedades. Por ejemplo, las variaciones de secuencia en muestras de adenocarcinoma de pulmón permitieron la detección de mutaciones raras asociadas con la enfermedad. Los sitios de unión de cromatina para proteínas nucleares específicas también se pueden identificar con precisión utilizando estos métodos
En general, la secuenciación del ADN se está convirtiendo en una parte integral de muchas aplicaciones diferentes.
Diagnóstico
La secuenciación del genoma es particularmente útil para identificar las causas de trastornos genéticos raros. Si bien más de 7800 enfermedades están asociadas con un patrón de herencia mendeliano, menos de 4000 de esas enfermedades se han vinculado definitivamente a un gen o mutación específicos . Análisis temprano del exón. El genoma, o exoma, que consiste en todos los genes expresados de un organismo, se mostró prometedor para identificar los alelos causales de muchas enfermedades hereditarias. En un caso particular, la secuenciación del genoma de un niño que padecía una forma grave de enfermedad inflamatoria intestinal relacionó la enfermedad con una mutación en un gen asociado con la inflamación: XIAP. Si bien el paciente inicialmente mostró múltiples síntomas sugestivos de una inmunodeficiencia, se recomendó un trasplante de médula ósea según los resultados de la secuenciación del ADN. Posteriormente, el niño se recuperó de la dolencia.
Además, HTS ha sido un actor importante en el desarrollo de una mayor comprensión de los tumores y cánceres. Comprender la base genética de un tumor o cáncer permite a los médicos tener una herramienta adicional en su equipo para tomar decisiones de diagnóstico. El Atlas del Genoma del Cáncer y el Consorcio Internacional del Genoma del Cáncer han secuenciado una gran cantidad de tumores y han demostrado que estos crecimientos pueden variar enormemente en términos de su paisaje mutacional.Esto también ha permitido comprender mejor el tipo de opciones de tratamiento que son ideales para cada paciente. Por ejemplo, la secuenciación del genoma del cáncer de mama identificó dos genes, BRCA1 y BRCA2, cuyas variantes patogénicas tienen un impacto enorme en la probabilidad de desarrollar cáncer de mama. Las personas con algunos alelos patógenos incluso optan por someterse a cirugías preventivas como las dobles mastectomías.
Biología Molecular
La secuenciación de ADN es ahora una parte integral de la mayoría de los laboratorios biológicos. Se utiliza para verificar los resultados de los ejercicios de clonación para comprender el efecto de genes particulares. Las tecnologías HTS se utilizan para estudiar variaciones en las composiciones genéticas de plásmidos, bacterias, levaduras, nematodos o incluso mamíferos utilizados en experimentos de laboratorio. Por ejemplo, una línea celular derivada de tejido de cáncer de mama; llamada HeLa, se usa en muchos laboratorios de todo el mundo y anteriormente se consideraba una línea celular confiable que representaba tejido de mama humano. Los resultados de secuenciación recientes han demostrado grandes variaciones en el genoma de las células HeLa de diferentes fuentes, lo que reduce su utilidad en biología celular y molecular.
La secuenciación del ADN da una idea de los elementos reguladores dentro del genoma de cada célula y las variaciones en su actividad en diferentes tipos de células e individuos. Por ejemplo, un gen en particular puede estar desactivado permanentemente en algunos tejidos, mientras se expresa constitutivamente en otros. De manera similar, aquellos con susceptibilidad a una enfermedad específica pueden regular un gen de manera diferente a aquellos que son inmunes. Estas diferencias en las regiones reguladoras del ADN se pueden demostrar mediante la secuenciación y pueden dar una idea de la base de un fenotipo .
Los avances recientes incluso han permitido a los laboratorios individuales estudiar las variaciones estructurales en el genoma humano; una empresa que necesitaba la colaboración global hace dos décadas.
Forense
La capacidad de utilizar concentraciones bajas de ADN para obtener lecturas de secuenciación fiables ha sido de gran utilidad para el científico forense. En particular, el potencial para secuenciar cada ADN dentro de una muestra es atractivo, especialmente porque la escena del crimen a menudo contiene material genético de varias personas. El HTS se está adoptando lentamente en muchos laboratorios forenses para la identificación humana.
Además, los avances recientes permiten a los científicos forenses secuenciar el exoma de una persona después de la muerte, especialmente para determinar la causa de la muerte. Por ejemplo, la muerte por envenenamiento mostrará cambios en el exoma de los órganos afectados. Por otro lado, la secuenciación del ADN también puede determinar que el fallecido tenía una enfermedad o predisposición genética preexistente. Los desafíos en este campo incluyen el desarrollo de software de análisis extremadamente confiable, especialmente porque los resultados de HTS no se pueden examinar manualmente.
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